한국의과학연구원

건강기능식품의 평가 중 장 건강 관련 기능성을 평가하기 위한 비임상평가인 동물실험에는 랫트(rat), 마우스(mouse) 등의 설치류 모델이 일반적으로 사용됩니다. 실험동물에서는 염증성 장질환, 장내 균총변화 모델 등을 사용할 수 있습니다. 실험동물을 대상으로 원료의 투여를 통해 장 건강 개선 지표를 측정하며, 원료의 작용 기전을 설명하기 위해 바이오마커의 양, 활성, 단백질 발현, mRNA 발현 등을 측정합니다. 하지만 최근에는 동물실험에 대한 반대 목소리가 커지고 있어 건강기능식품을 복용하는 임상에 의한 평가로 진행이 되는 경우가 많아지고 있는 추세입니다.

건강기능식품(기타가공품을 포함)에 대한 임상평가는 처음 설계시 과연 얼마의 인원으로 어느 정도까지 수행을 해야 할지에 대한 문제가 대두됩니다. 이는 개발하는 제품이 제약영역이나 건강기능식품 개별인정형으로 진행할지 아니면 단순하게 효과를 파악하는 정도로만 수행할지에 따라서 그 절차와 수행 방식은 수십 가지로 나눠지게 됩니다.

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한국의과학연구원은 한국인의 장내 환경에 최적화된 건강기능식품 및 의약품의 바이오마커 항목에 대한 유효성평가 프로세스를 개발하여 유효성을 객관적으로 수치화할 수 있는 길을 열었으며, 장내에 존재하는 유익균과 유해균의 균체수 변화 및 장내 미생물 군집의 다양성 변화를 확인하여 장내 환경의 개선 효과를 확인하였습니다. 또한 정부 R&D 자금을 지원받아 2014년부터 산학연 공동으로 '한국인 장내미생물 프로젝트'를 수행하여 누적인원 2만명이 넘는 한국인의 장내미생물 분석결과를 데이터베이스화하였습니다. 이를 토대로 한국인 표준 장내환경을 설정하기 위한 연구를 이어오고 있습니다.

01마이크로바이옴 정성분석&정량분석

한국의과학연구원에서는 산.학.연 및 병원과 연계하는 공동연구로 건강기능식품에 대해 미생물군집을 확인하는 정성분석인 NGS(Next Generation Sequencing)분석과 정량분석인 장내세균분석(GMA:Gut Microbiota Analysis)을 도입하여 유효성 평가를 진행하고 있습니다. 정성분석과 정량분석을 병행하여 장내미생물 유효성 평가를 통해 건강기능식품의 유효성을 평가하는 시스템을 구축하였으며, 분석 Big Data기반을 바탕으로 기존에 평가되지 못한 영역이 하나둘 확인되고 있습니다. 건강기능식품에 대한 유효성 확인을 위해 확보된 분변(Fecal)샘플에는 장내미생물에 대한 정보 외에 많은 건강관련 정보 및 제품 섭취에 따른 유효성을 확인할 수 있으며, 다양한 각도에서 복용군과 비복용군의 결과를 비교하여 건강기능식품의 기능성 확인을 위한 유효성 판단을 보다 정확하게 파악할 수 있습니다.

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  [NGS 정성분석 결과]

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  [장내세균분석(GMA) 정량분석 결과]

02단쇄지방산 분석(Short Chain Fatty Acids)

난소화성 다당류 섭취 시 장내균총에 의해 생성되는 단쇄지방산(SCFA)은 대장 내 세균의 세포 증식을 촉진시키고, 대장 내 질소를 세균의 단백합성에 이용하게 하여 결과적으로 대장 내 질소를 감소시킵니다. 또한 생성된 단쇄지방산은 장 내 pH를 저하시켜 높은 pH 조건에서 성장하기 쉬운 유해균을 억제시키고, 유해효소의 활성을 저해함으로써 건강에 유익한 장내균총 환경을 형성하는 역할을 합니다. 단쇄지방산 농도 변화와 질병 발생 사이의 연관성을 고려하면, 다른 생물학적 샘플에서 이러한 산을 정량화하는 방법이 중요하며, 제한적이고 복잡한 생물학적 샘플에서 단쇄지방산을 정량화하는 가장 일반적인 방법으로는 GC-MS(Gas Chromatography Mass Spectrometry) 측정법이 있습니다.

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  [SCFAs 분석 결과]

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  [GC-MS 측정]

03Calprotectin 분석

Calprotectin은 분자량 36KDa의 칼슘-아연 결합 단백질입니다. 단구와 대식구에도 나타나기도 하며, 대부분 호중구 세포질에 존재하는데 염증 자극으로 분리되어 체내 염증상태를 반영하는 생물학적 표지자(biomaker)입니다. 특히 분변 칼프로텍틴은 세균 대사활동에 저항성이 있고, 효소에 의해 분해되지 않는 안정적 단백질이기 때문에 소화기계 염증을 진단하는데 사용할 수 있으며 염증성장질환 감별진단, 치료효과, 추적검사 등으로 임상검사에 이용됩니다.

04β-glucuronidase 분석

글루쿠론산분해효소, 베타-글루쿠로니데이스[글루쿠로니다제] 천연 또는 합성 글루쿠론산 화합물의 글루코사이드결합을 분해하는 효소. 에스트로젠대사 및 세포분열에 관여합니다. 비장, 간 및 내분비선에 존재한다.장내효소로 알려진 β-glucuronidase를 분석함으로서 개발하는 건강기능식품의 정장작용의 정도를 판단할 수 있습니다.

유효성 평가가 완료된 후 얻어진 결과에 대한 정리 및 해석에 있어서 평가계획의 시기이상으로 임상 및 비임상 시험수탁기관, 시험실시기관, 시험분석기관간의 상호 유기적인 협력이 필요합니다. TB(Tera Byte)급 용량의 결과가 쏟아져 나오는 Metagenome분석의 시기에 자칫 Data의 바다에 빠져 옥석을 구분하지 못하는 우를 범할 수 있기 때문입니다. 한국의과학연구원 분석센터에서는 초기 임상/비임상평가 계획에서부터 분석수행 과정 뿐만이 아닌 결과에 대한 해석에 있어서도 오랫동안 축적해온 Bioinformatics 관점의 결과 해석의 지원으로 소중한 유효성평가 진행의 결과가 빛을 발하도록 돕고 있습니다.

한국의과학연구원에서는 대상균주(또는 균주 그룹)에 대한 정량분석을 위한 사전역량을 확보하고 유효성 평가의 전-후 개선 정도, 연구과정 중의 특정 균주에 대한 정확한 균체수 측정을 필요한 모든 연구에 적용하고 있습니다.

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코로나19 팬데믹 이후 많은 사람들이 건강에 대한 인식과 관심이 높아지면서 장 면역력 강화를 위하여 건강기능식품인 프로바이오틱스 소비가 증가하고 있습니다.

프로바이오틱스는 일정량 섭취시 인체에 유용한 보건 효과를 나타내는 살아있는 미생물 종으로 정의됩니다. 보편적으로 섭취하는 제품인 만큼 최소한의 안전성을 위해서 2002년 국제연합식량농업기구(FAO) 및 세계 보건기구(WHO)에서 식품 영역에서의 프로바이오틱스의 안전성 평가 가이드라인을 개발했으며, 국내에서는 이 가이드라인을 참조하여 2021년에 건강기능식품 기능성원료 프로바이오틱스 안전성평가 가이드가 제정되었습니다.

프로바이오틱스는 살아있는 생균 상태여야 효능을 나타낼 수 있으며, 비병원성 균주로써 독성이 없어야 하고 식약처에서는 19종의 균주를 프로바이오틱스로 고시하여 관리하고 있습니다. 또한 가이드에 따라 고시된 균주인지, 식경험이 있는 균주인지에 따라 여러 시험을 치뤄 문제가 없어야 사용이 가능합니다. 한국의과학연구원은 안전성 평가 가이드라인에 따라 미생물의 안전성을 평가하는데 충분한 연구자료와 노하우를 가지고 있으며 기업들의 개발 기간을 단축할 수 있도록 안전성 평가 전문성 향상에 힘쓰고 있습니다.

우리가 섭취하는 프로바이오틱스 제품 대부분이 식약처 고시형 19종에 포함됩니다. 이 균주는 항생제 내성, 용혈 활성, 독성 생성 여부, 대사적 특성에 대해 안전성 평가가 이루어집니다.

01항생제 내성

항생제 내성 유전자를 가지고 있으면 세균 감염 시 항생제의 효과가 나타나지 않을 수 있어 위험하고, 장 내에서는 항생제 내성 유전자의 전이가 많이 일어날 수 있으므로 미생물이 가진 항생제 내성의 특성을 파악하는 것은 무엇보다 중요합니다.

미국 CDC에서는 strip 기반의 항생제 내성 최소항생제억제농도(Minimum Inhibitory Concentraion, MIC) 시험의 편리성과 결과 균일성에 E-TEST 방법을 추천하고 있습니다. MIC 확정 후 EFSA(European Food Safety Authority) 기준에 따라 미만인 경우에는 사용이 가능할 수 있으나, 초과되는 경우에는 획득성 또는 내재성 내성여부를 판단해야 합니다.

02용혈 활성

균주가 용혈활성을 가지고 있으면 숙주의 적혈구를 파괴시키므로 이를 확인하여 안전성을 평가하여야 합니다.

※ 시험방법은 미국 America Society for Microbiology 가이드라인 참고

03독성 생성

프로바이오틱스가 독성을 생성할 경우 인체에 유해한 결과를 초래할 수 있으므로 세포를 기반으로 in vitro를 통해 확인해야 합니다.

• LDH assay

  LDH(Lactate dehydrogenase) assay는 독성에 의해 세포가 파괴된 후 나오는 LDH의 양을 측정하여 세포의 사멸도를 측정하는 방법

• MTT assay

  MTT 시약을 이용하는 tetrazolium assay는 노란색의 수용성 MTT tetrazolium을 세포에 처리하면 살아있는 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 tetrazolium의 ring 구조가 끊어지면서 보라색을 띄는 비수용성 MTT formazan 결정으로 환원되는 원리를 이용하여 세포의 사멸도를 측정하는 방법

04대사적 특성

• D-lactate production

  인체의 경우 L-lactate는 대사가 가능하지만, 이성질체인 D-lactate의 경우엔 대사가 불가능합니다.. 프로바이오틱스의 경우 L-lactate를 D-lactate로 변환하는 효소인 DL-lactate racemase를 가지고 있어 효소 활성이 강한 경우에는 신생아나 어린아이 그리고 선천성단장증후군(short bowel syndrome) 환자에게 D-lactate가 축적되어 산독증(acidosis)을 유발할 수 있습니다.

• Bile salt deconjugation

  Bile salt의 경우 지방을 유화하여 lipase의 작용을 촉진하여 지방산 분해에 도움을 주며, 프로바이오틱스에 존재하는 bile salt hydrolase는 bile salt로부터 프로바이오틱스를 보호하여 장내 정착을 늘리기도 하지만, bile salt를 deconjugation 시켜 bile salt의 유화기능을 없애기 때문에 지방산 분해를 어렵게 합니다. 또한, deconjugation 된 bile salt의 경우 다른 장내 미생물의 대사에 의해 독성을 가진 2차 대사산물이 생성되며, 이는 잠재적으로 위험성을 가질 수 있습니다.